IAA为什么“更难测”？一文解析背后的免疫学与检测学原因

一、胰岛自身抗体（IAA）的基本概念与免疫学特征

       胰岛素自身抗体（Insulin Autoantibody, IAA）是机体针对内源性胰岛素产生的特异性自身抗体，是胰岛β细胞自身免疫反应的重要标志物之一。在1型糖尿病发生过程中，IAA往往是最早出现的自身抗体之一，甚至可在临床发病前数年即被检测到[1]。

       IAA的产生本质上是免疫耐受破坏的结果。在具有遗传易感性的个体中（如HLA-DR3、DR4等，以及不同人群中具有差异的其他HLA易感基因型），感染、饮食及肠道微生态等环境因素可能参与免疫耐受失衡和胰岛自身免疫的发生，但具体机制仍在研究中。B细胞在T细胞辅助下产生自身抗体，即IAA。

       临床上还存在另一类胰岛素抗体，多见于外源性胰岛素治疗后产生，因其成因不同，对应的免疫学意义和指导意义存在较大差异[2]。内源性胰岛素与外源性胰岛素在抗原决定簇上几乎一致，测得的胰岛素抗体不能区分靶抗原来自内分泌系统还是体外注射，因此实践中需要结合患者胰岛素用药史解读抗体报告。对于IAA阳性但接受胰岛素治疗两周以上的患者，通常不作为自身免疫性糖尿病的辅助标志物。由于外源性胰岛素治疗可诱导胰岛素抗体产生，因此对于已经接受胰岛素治疗的患者，胰岛素抗体结果需要结合用药史谨慎解释，不能单凭阳性结果判断是否存在针对内源性胰岛素的自身免疫反应。

二、IAA检测难度高的核心原因

        相比GADA或IA-2A等已在临床广泛开展的胰岛自身抗体检测，IAA被认为是最难检测的项目之一，其难度来源于标志物本身特性、检测方法局限以及样本干扰等多重因素。

1.低浓度与抗体异质性

       IAA通常具有较低的抗体水平和较低的抗体容量，尤其是在疾病早期及部分低水平阳性样本中，检测信号可能接近检测阈值。同时，不同个体之间IAA在亲和力和对胰岛素的表位识别上存在显著差异[3]。由佛罗里达大学牵头、全球多家中心联合开展的抗体检测标准化评估项目DASP显示，IAA仍然是当下各中心间重复性和一致性最差的自身抗体之一，这一现象与其异质性密切相关[4]。

2.抗原-抗体复合物的影响

        IAA具有不同的亲和力和结合特性，部分IAA可与循环中的胰岛素形成免疫复合物，其结合状态可能受到抗体亲和力、抗体容量以及抗原浓度等因素影响。当IAA与内源性胰岛素形成免疫复合物后，抗体的可检测性可能受到影响；不同检测体系对游离抗体和结合态抗体的识别能力不同，因此可能造成检测结果差异[5]。结合态的抗原抗体复合物在特定理化条件下会发生解离，将超量的胰岛素释放入血产生降血糖作用，导致患者出现反复低血糖。这其实引申出临床中另一类IAA所致疾病——胰岛素自身免疫综合征(IAS)的致病机制，在此不做赘述。针对这部分被掩盖的抗体，部分研究中通过外部因素促使抗原抗体复合物解离的前处理手段，因抗体外部理化环境改变，其对检测效能的影响尚缺乏明确评估。

3.固相检测体系的固有短板

       对于部分以固相胰岛素作为抗原的检测体系，抗原固定可能改变或遮蔽部分构象表位，从而影响特定IAA的识别[6]。同理，部分对胰岛素抗原进行标记物修饰的检测体系，也可能因为修饰过程对表位进行改变或遮蔽，导致影响IAA的识别。

4.低亲和力抗体易在检测中流失

       IAA中有一部分在体内为游离态低亲和力抗体，这类抗体在检测过程中经过洗涤或固相结合步骤时容易解离，导致检测信号丢失。研究表明，对于亲和力较低或结合动力学较弱的IAA，检测过程中的固相结合、洗涤以及抗原构象变化均可能影响抗体的保留和最终信号。如下图所示，高亲和抗体(左)可以完整识别靶抗原，而低亲和抗体(中右)与靶抗原间的结合因接触面积小，更依赖对构象和有限抗原表位的识别。

5.小分子抗原的标记与构象挑战

       胰岛素分子较小，约6 kDa，仅由51个氨基酸组成，并具有由二硫键维持的特定三维结构。因此在抗原固定或标记过程中，任何可能改变关键构象表位的操作，都可能影响部分IAA的结合，对于主要识别构象表位的自身抗体而言，这种影响尤其值得关注。

       传统方法在抗原上使用HRP/ALP等酶实现标记，因酶分子量远大于胰岛素，标记后蛋白空间变化导致电荷改变，影响IgG与标记抗原的顺利结合，降低检测效能；选用更小分子量的生物素-链霉亲和素（Biotin-SA）路线虽然规避了标记物与抗原间的电荷干扰，但对于小分子抗原而言，标记位点和标记程度的差异可能影响抗原构象及表位暴露，因此需要对标记策略进行严格优化。

三、液相放射性结合分析（RBA）：IAA检测的优化解决方案

       液相放射性结合分析（RBA）相对有效解决了上述检测难题，并已实现商业化检测。

       1. RBA方法是液相反应，最大程度保留抗原天然构象，避免了ELISA和化学发光法因固相屏蔽造成的灵敏度降低的问题。

       2. 标记中不引入分子物基团，特别适合标记小分子量抗原，并且保证了实验的特异性，避免非特异结合。

       3. 在优化的液相放射性结合体系中，¹²⁵I标记抗原可以提供较高的检测信号与较低的背景，从而适用于低水平IAA的检测。

       4. 更加重要的是，RSR采用基于液相放射性结合原理的IAA检测方法（RIA），利用胰岛素A链上的第14位酪氨酸，将抗原自带的酪氨酸转化为放射性标签，不改变分子结构，不干扰构象，保留完整抗原性：

图注：标记所在的酪氨酸(Tyr)在胰岛素中的定位，在优化标记条件下，尽可能降低标记对胰岛素免疫反应性的影响；酪氨酸碘化取代为放射性标签的反应，不引入新基团，不改变抗原宏观结构

       5. 在液相体系中，患者血清与放射标记胰岛素共同孵育，在稳定环境中捕获血清中的游离IAA形成复合物，通过充分的反应时间，配合液相环境共同减少体系中的非特异结合，提高准确性。液相反应和充分孵育有助于提高抗原与抗体的有效结合，并降低部分非特异性干扰，从而改善检测性能。

       6. 还有一类特殊的“测不准”情形。由于天然人胰岛素与部分胰岛素类似物具有较高的结构同源性，接受外源性胰岛素或胰岛素类似物治疗后产生的胰岛素抗体，可能与检测体系中的胰岛素抗原发生结合。因此，已经接受胰岛素治疗的患者，其IAA结果需要结合用药史进行解释。《第四版全国临床检验操作规程》（尚红，2015）在检测项目命名与常规报告层面，不再区分IA（外源性胰岛素抗体）和IAA（胰岛素抗体）做出区分。同时明确：现有常规检测方法本身无法区分二者，只能靠临床病史（是否使用过外源性胰岛素）来鉴别，不能依靠检验结果本身区分。对于尚未接受胰岛素治疗的患者，IAA阳性通常提示体内存在针对内源性胰岛素的自身免疫反应，是1型糖尿病早期免疫损伤的重要证据之一，在婴幼儿和儿童新发糖尿病中具有较高的诊断价值，青少年和成年糖尿病患者中可作为其它胰岛自身抗体(GADA、IA-2A、ZnT8A)的补充；对于已经接受胰岛素治疗的患者，体内胰岛素抗体的靶抗原可能已经受到外源胰岛素的干扰。这类患者的报告应结合胰岛素用药史、胰岛自身抗体结果等综合评价IAA结果，来鉴别胰岛存在自身免疫，或是导致胰岛素治疗效果不佳，血糖波动大等的病因。

四、RBA与RIA的关系及临床开展现状

       RBA (Radioligand BindingAssay，放射配体结合分析)是大类，RIA属于RBA的一个分支。放射性标记配体、竞争性结合蛋白、B/F分离测结合计数的实验，都归到放射配体结合分析这个大家族。放射免疫法（RIA）在公立医院临床实验室的开展受放射性核素管理的限制，有放射免疫资质的专业实验室建立放免检测作为参考方法用于临床科研与实验室标准化评估，为临床疑难病例提供辅助依据。

注：本文为疾病理论知识科普，仅供医学专业人士及学习目的参考，不构成诊疗建议。

参考文献：

[1] ZIEGLER A G, REWERS M, SIMELL O, et al. Seroconversion to multiple islet autoantibodies and risk of progression to diabetes in children[J]. JAMA, 2013, 309(23): 2473‑2479.

[2] AMERICAN DIABETES ASSOCIATION PROFESSIONAL PRACTICE COMMITTEE. Standards of Care in Diabetes—2024[J]. Diabetes Care, 2024, 47(Suppl 1): S1‑S218.

[3] ACHENBACH P, KOCZWARA K, KNOPFF A, et al. Mature high‑affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes[J]. The Journal of Clinical Investigation, 2004, 114(4): 589‑597.

[4] BONIFACIO E. Predicting type 1 diabetes using biomarkers[J]. Diabetes Care, 2015, 38(6): 989‑996.

[5] BINGLEY P J. Clinical applications of diabetes antibody testing[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2010, 95(1): 25‑33.

[6] ACHENBACH P, GUO L H, GICK C, et al. A simplified method to assess affinity of insulin autoantibodies[J]. Clinical Immunology, 2010, 137(3): 415‑421.